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中量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)

浏览数:  发表时间:2019-08-09  

  1. 将菌液倒入装有 50mL TB 的锥形瓶中,或从培养好的平板上挑取单克隆,锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600 到10-12。(OD600 到40 为用TBS 培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度,2. 将培养好的菌液到入国产 50mL 离心管中,每管不超过45mL。(有实验表明,若往离心管中装入超过45mL 的液体,离心后,液体的终体积仍为45mL。因此,一次不应离超过45mL 的液体,否则将污染离心机。)4. 加 P1-RNase 至终体积到7mL,震荡重悬至菌均匀分散。(按该法最多只能裂解45mL 13OD 的细菌,如需裂解更5. 加 14mL P2,盖上盖子,上下颠倒混匀2min。www.23918.com,(该步一定要混匀,以达到将细菌完全裂解的目的。加入P2 后可见溶6. 加 7mL P3。(P2 和P3 之间反应时间不要超过5min。混匀后可见絮状沉淀。该步若置于冰上,沉淀效果更好。但位于室温的反应7. 室温(4 度更好,但没有必要。)离心,10,000 rpm, 5min。8. 将上清用滤纸过滤至另一国产的 50mL 管中。加0.6 倍体积的异丙醇,颠倒混匀后室温(不可置于4 度。若置于4 度,万众11彩图图库!将会使部分盐析出)静置10min。(分子克隆p35)10. 弃上清,在加 1.8mL H2O 溶解完全后,平均分至两个1.5mL 管中,再分别往每管中加入二分之11. 3,000 rcf 离心3min,弃上清。(可以不要非常完全控干)12. 加 1.55mL CsCl 溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000 rcf 3min 离心,弃去不溶物质。13. 往 2mL 超速离心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷纸把枪头外壁的EB 擦干。(将外壁的EB 擦干14. 将 DNA 移至2mL 超速离心管中,并用H2O 将体积补至2mL。(此时,溶液的密度为3.10g/2mL,共含1.55g CsCl。)15. 配平至对称管重量差0.02g,封口。(该步配平时,可按1ulH2O 重0.001g 来补加H2O 进行配平以缩短时间。)在封口16. 打开超速离心机,按 Memu - Programme - Plasmid-CsCl - OK。(该步为149,000rpm 2h 升速max 降速17. 按 Vacuum 至线 后按 Start。(不等线 其实也可启动,但这可能将造成离心机反复升降速,故制定此规则。)等升至最大转速后才能离开。(该步为离心机安全操作必须,请务必做到。)18. 2h 后,取出转头,离心管。若转头内有液体需将其洗净,擦干。(因为此时泄漏的液体含有EB,因此需要19. 先用 8 号针头在离心管上部插个洞,再用1mL 注射器抽出所需的红色DNA 条带至1.5mL 离心管20. 加入 1mL 水饱和正丁醇,上下颠倒混匀(勿用振荡器)约20 下。(或更多,使上部液体尽可能变红。)将1.5mL 管置于离心机中,按Short 键 5 秒,松手。弃去上层液体。(离心的目的是为了加速液面分层,因此21. 重复 20 步2-3 遍,至下层看不到红色后再萃取一遍。(再萃取一遍的目的是为了确保EB 完全去除。)22. 往溶液中补加等体积的 H2O,平均分成若干管,使每管终体积为400ul。往每管中分别加入1mL(2.5倍体积)无水乙醇,颠倒混匀。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。(该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。)23. 加 1mL 预冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。(该步的目的是为了除去21 步中管壁上残留24. 加 400ul H2O 或TE 溶解。(对于高拷贝质粒,45mL 菌液将获得500-1,500ug 左右质粒。)


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